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Tomáščermák是明尼苏达大学生物科学学院的研究专家。

您能简要概述研究的目标吗？

尽管自发现TALEN和CRISPR/CAS9核酸酶以来，基因组工程领域一直在迅速发展，但对植物基因组进行精确的修饰仍然是一个挑战。到目前为止，只有少数小组成功地以定制方式改变了作物植物的基因组。

我们决定开发更有效的方法，以使植物中的基因靶向较小，并表明它们可以应用于重要的农作物物种中。

为什么过去很难修改植物基因组？

过去，我们没有有效的工具来以受控的方式操纵基因组。现在发生了变化，Talens，CRISPR/CAS9或其他类型的位点特异性核酸酶可用于在感兴趣的基因中诱导靶向的双链断裂。

然后，通过诱变的非同源末端连接来修复这些断裂，这通常会导致基因失活，或者较少频繁地通过同源重组，从而导致精确的修复。因此，这些工具现在已经到位，但是在修改专门的植物基因组方面仍然存在其他挑战。

受细胞壁保护的植物细胞不容易服用外源性DNA，必须将其强加于生物存在或使用生物学剂。

主要问题在于效率低下的方法（与许多动物细胞系统相比）将DNA传递到植物组织中。受细胞壁保护的植物细胞不容易服用外源性DNA，必须将其强加于生物存在或使用生物学剂 -农杆菌tumefaciens。

如果将单个副本转基因插入基因组，这不是一个大问题。位点特异性核酸酶转基因的一个副本通常也足以诱导靶向基因敲除。

但是，基因靶向（通过使用同源重组的精确定制修改引入定制修饰）需要一个供体DNA分子，该分子带有所需的修饰，以用作模板来复制信息并修复休息时间。

增加细胞中这些供体分子的拷贝数增加了一个机会，将用作修复模板。但是，很难通过上述方法调节外源输送到植物细胞的DNA的拷贝数很难，通常只能传递一个或几个副本。

您的技术与传统方法有何不同？

以前用于植物中基因靶向基因靶向的大多数方法都使用植物原生质体（无细胞壁）作为DNA递送的起始材料，或农杆菌- 介导的DNA递送到植物组织中。

此外，许多人使用预先插入的着陆垫或转基因作为目标。虽然将DNA递送到原生质体中比完整的组织要容易得多，但从原生质体中再生的整个植物需要很高的专业知识，并且只有在几种植物中才有可能。

我们合并了农杆菌- 带有新的系统来复制植物细胞中DNA供体分子的新系统，以增加靶向频率的基因。

另一方面，农杆菌- 介导的交付具有上述缺点，但仍然是最常用的转换方法。我们合并了农杆菌- 带有新的系统来复制植物细胞中DNA供体分子的新系统，以增加靶向频率的基因。

供体模板放置在双子座病毒复制子上，该复制品从农杆菌T-DNA，圆形并复制成数千份，与传统方法相比，DNA的转化明显更大。

虽然我们以前在烟草愈伤组织/plantlet中发表了这种方法的概念证明，但在当前的研究中，我们将其用于第一批作物物种番茄的使用，该物种以前尚未通过基因靶向进行修改。

我们生成了修改的植物，并表明修饰是可遗传的。我们瞄准了一个内源性基因，并首次证明了易于自定义的内切酶（CRISPR/CAS9和TALENS），可以与此方法结合使用。

也许最重要的是，与植物中的其他基因靶向方法不同，我们表明T-DNA的整合对于用Genimivirus Replail子实现基因靶向并不是必不可少的，Genimivirus复制剂与使用我们的方法制作的作物品种的调节状态相关。

您发现该研究具有挑战性的研究是否有特定方面？

在新物种中实施新方法总是很具有挑战性的。最大的挑战是优化了用基因靶向事件恢复植物的整个过程，这是要求的，需要大量时间。

对于番茄或其他农作物，该技术的可能应用是什么？

我们的方法不仅可以通过进行有针对性的修改来进一步发展基本生物学，从而进一步了解我们对基因功能的理解，而且还可以用于作物改善以创造新的感兴趣特征。

这项技术使我们能够通过扩展靶向基因插入，基因堆叠或基础替代氨基酸/等位基因替代的基因组编辑结果的清单，从而利用植物中基因组工程的全部潜力。番茄和其他农作物中有许多特征可以使用该技术进行优化。

您希望将来会进一步发展？

未来最受欢迎的目标是使植物的基因靶向如此有效，以至于不需要选择来识别改良的植物。

尽管我们的方法代表了植物基因组工程的重大进展，但对植物基因组进行精确的修改仍然远非常规。未来最受欢迎的目标是使植物的基因靶向如此有效，以至于不需要选择来识别改良的植物。

我们通过解决植物细胞中基因靶向的重要方面（供体模板的可用性），将其移动了一步。在下一步中，我们想消除农杆菌转换并使复制子具有竞争力（能够从细胞到细胞移动）。

这将导致携带基因组工程试剂从主要转化到其他细胞的复制子扩散，并进一步提高基因靶向效率。