在短短几年内，一项被称为“CRISPR”的技术不仅改变了科学家对DNA进行特定改变的方式，而且还改变了人们治疗疾病的方式。与此同时，微生物界的CRISPR-Cas系统加速了新的基因组工程工具箱的出现。

一个新的研究基因组生物学博士领导的研究小组完成,李魏动物学研究所,中国科学院,为我们提供了更多的可行的Cas12a / Cpf1直接同源,CRISPR-Cas-based基因组工程扩展我们的选择,提高了定位效率Cas12a酶通过工程和优化CRISPR RNA (crRNA)脚手架。

新兴的crispr - cas介导的基因组编辑技术在基础研究和生物医学应用方面有着广阔的前景。截至目前，CRISPR-Cas系统已被提名6个类型，20多个亚型。其中，CRISPR-Cas12a是用于编辑哺乳动物基因组的第二种CRISPR-Cas系统(V型)。

我和我的同事“挖掘”了数据库，并确定了几个新的CRISPR-Cas12a位点，这些位点已被用于执行哺乳动物基因组编辑功能。

Cas12a具有独特的特性，是CRISPR-Cas9系统的互补。然而，仍存在一些缺点，如基因组覆盖率较低和靶向效率较低，需要改进。

扩展的剧目Cas12a工具箱

在我们最近的研究中，发表在基因组生物学，我和我的同事“挖掘”了数据库，并确定了几个新的CRISPR-Cas12a位点，这些位点已被用于执行哺乳动物基因组编辑功能。我们证明了6个新的Cas12a同源基因能够在哺乳动物细胞中编辑基因组。

我们发现V-A型Cas12a系统是保守的，特别是在成熟的crRNA序列和第二结构中。在守恒的基础上，我们推断出它们的必要守恒PAM序列．作为我们的在体外数据表明，这些新鉴定的Cas12a核酸酶利用富含5’t的PAM。因此，我们为Cas12a核酸酶提供了更多的选择，这些酶能够强大地编辑哺乳动物基因组。

使用非标准PAMs增加基因组覆盖率

我们还发现，这6种Cas12a同源基因中的一些可以识别更简单的5 ' -TTN PAM，这表明总体上，与广泛使用的AsCas12a和LbCas12a相比，基因组覆盖率增加了4倍。此外,在我们的在体外裂解实验发现，HkCas12a可以利用非标准PAMs (5 ' - yyn和5 ' - tbbn -)。虽然在细胞系中PAM序列测定较少，但我们也可以使用5 ' -YTN和5 ' -TYYN PAM对HkCas12a进行哺乳动物基因组编辑。与正规的5 ' -TTN PAM相比，HkCas12a识别的PAM在哺乳动物基因组中的靶向范围增加了3倍。

利用优化的crRNA支架提高Cas12a蛋白的靶向效率

在我们的研究中，我们观察到不同的crRNA支架可以影响Cas12a蛋白的靶向效率，尽管在大多数情况下它们会降低甚至消除Cas12a蛋白的活性。但在极少数情况下，crRNA支架loop区域的一些改变能够增加Cas12a核酸酶的活性。我们成功地筛选出一种变体(crRNA4n96)，它可以显著提高cas12a介导的基因组编辑效率。

总的来说，我们开发了6个新的Cas12a基因组编辑工具箱，增加了基因组的覆盖范围，为我们提供了更多的基因组编辑选择。重要的是，通过工程和优化crRNA支架，我们提高了Cas12a同源物的靶向效率。